検体数 ＆ コントロール設定
全ステップ即時連動
基本検体数 (n)
ダニ破砕 ＆ RNA抽出
4
検体
Luna RT 陰性対照
Luna2+水8
Luna 2µL ＋ 水 8µL (MM 9µL ＋ 水 1µL)
+1
本
PCR 陰性対照 (NTC)
H₂O
PCR独自の水コントロール
+1
本
抽出:4
➔
Luna:4+1
➔
PCR:4+1+1
(=6)
PHASE 01
LPA 3.0 µL / 検体
🧬 QIAamp Viral RNA 抽出
🧪 Buffer AVL ＋ LPA（リニアアクリルアミド）調製
1.5mL管 2 本用意
💡 1.5mL チューブ調製レシピ（容量都合: 最大2サンプル/管）:
(1.12 mL ＋ 6.0 µL) × 2本
1.5mLチューブ 2本 にそれぞれ AVL 1.12 mL と LPA 6.0 µL を投入・混合
Buffer AVL 合計総量:
2.24 mL
LPA (リニアポリアクリルアミド) 合計:
12.0 µL
👉 サンプル溶解時、各検体チューブ（1.5mL管）にこの混合液を 560 µL ずつ分注します。
100% エタノール
2.24 mL
各管 560 µL 混合
Buffer AVE (溶出液)
240 µL
各管 60 µL (室温)
🔬 前処理: ダニ破砕 (PBS 500 µL/検体)
2.00 mL
PHASE 02
半分量 10 µL系
🔄 LunaScript 逆転写 (cDNA)
Luna 合計チューブ数: 5 本 (4＋ネガコン+1)
調製: ×5.5本分 (+10%)
💡 ネガコン RT(-) (1本): Luna 2.0 µL ＋ 滅菌水 8.0 µL（＝共通MM 9.0 µL ＋ 滅菌水 1.0 µL）で調製し、Phase 03 PCRへ連動。
🧪 チューブで混ぜるマスターミックス (MM)
終濃度 1.0X
Nuclease-free Water (7.0 µL/本):
30.8 µL
LunaScript RT (5X) (2.0 µL/本):
8.8 µL
▶ MM 調製総量:
39.6 µL
👉 各チューブへの分注 ＆ 添加:
・検体管 (4本):
MM 9.0 µL ＋ RNA 1.0 µL
・RT(-) ネガコン (1本):
MM 9.0 µL ＋ 滅菌水 1.0 µL (Luna 2 + 水 8 µL)
PHASE 03
20 µL系 / 反応
⚡ KOD One PCR 増幅
反応スケール:
PCR合計本数:
6
本
調製: ×7.0本分 (+1.0本)
検体cDNA
4
＋
Luna連動
＋
+1
PCR NTC
+1
🧪 まとめて混ぜるマスターミックス (MM)
終濃度 1.0X
滅菌蒸留水 (NFW) (7.4 µL/本):
51.8 µL
プライマー mix (各10µM) (0.6 µL/本):
4.2 µL
KOD One PCR MM (2X) (10.0 µL/本):
70.0 µL
▶ MM 調製総量:
126.0 µL
👉 各チューブへの分注 ＆ テンプレート添加
各管 20.0 µL
① マスターミックス分注:
全 6 本のチューブに MM を 18.0 µL ずつ分注
② テンプレート添加（各管 2.0 µL）:
・検体チューブ (4本):
各 cDNA 2.0 µL
・Luna RT(-) 連動管 (1本):
RT(-)液 2.0 µL
・PCR 陰性対照 (NTC: 1本):
滅菌水 2.0 µL